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|a Der Replikation des NV-Genoms geht die kotranslationale Spaltung des vom ORF1 kodierten Polyproteins durch die viruseigene Protease, voraus. Erst in cis und in trans Prozessierungen an definierten Spaltmotiven innerhalb des Polyproteins ermöglichten die Freisetzung der strukturellen und nicht-strukturellen Proteine, die für den Aufbau des Replikationskomplexes und für die Initiation der Replikation essentiell sind. Die Regulation der Polyproteinprozessierung war allerdings bislang unbekannt. In der Charakterisierung der sequentiellen und differentiellen Prozessierung des Polyproteins bestand demnach die Hauptaufgabe dieser Arbeit. Dafür wurde zunächst ein NV-Volle-Länge-cDNA-Klon aus sechs sich überlappenden cDNA-Einzelfragmenten, unter Verwendung der overlap-extension PCR, hergestellt. Dieser Volle-Länge cDNA-Klon diente als Template für die Generierung von Vorläuferkonstrukten, die für die Charakterisierung der in cis und in trans Prozessierung des Polyproteins verwendet wurden. Die cis-Spaltung des Polyproteins konnte sowohl in E.coli als auch in humanen 293-T Zellen anhand eines Vorläuferproteins, das die komplette Sequenz der 3CLpro enthält, die 5`-seitig von der Spaltstelle zum VPg Protein und 3`-seitig vom N-Termins der 3DLpol flankiert ist, verifiziert werden. Infolge der kotranslationalen cis-Spaltung dieses Vorläuferproteins kam es zur Freisetzung der 3CLpro, die anschließend aufgereinigt wurde. Zusätzlich wurde das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol aufgereinigt, bei dem das Spaltmotiv E/G zwischen der 3CLpro und der 3DLpol so mutiert wurde, dass die kotranslationale Spaltung des Fusionsproteins verhindert wurde. Anhand der 3CLpro sowie dessen Vorläufers 3CLproµE1189A3DLpol sollte die differentielle und sequentielle Spaltung des Polyproteins in trans charakterisiert werden. Dafür wurden synthetisch hergestellte Peptide, die die authentischen Spaltmotive innerhalb des Polyproteins aufwiesen, sowohl mit der 3CLpro als auch mit der 3CLproµE1189A3DLpol in einem trans-Spaltungsassay inkubiert und anschließend die Spaltung mit Hilfe der reversed-phase Chromatographie analysiert. Im Rahmen dieser Versuche konnte gezeigt werden, dass nur die Spaltmotive zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase sowie zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 in trans von der 3CLpro gespalten wurden. Massenspektrometrische Analysen wiesen nach, dass die Spaltungen jeweils zwischen den Aminosäureresten Q/G stattgefunden hatte. Zusätzlich zu den Peptiden p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 konnte das Peptid VPg/3CLpro durch das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol an der Schnittstelle E/G prozessiert werden. Anhand von Berechnungen zur relativen Spalteffizienz von 3CLpro und 3CLproµE1189A3DLpol wurde nachgewiesen, dass 3CLpro eine signifikant höhere Spezifität zu den Spaltmotiven der Peptide p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 aufwies als das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol. Die Spaltspezifität der 3CLpro war dabei an dem Spaltmotiv zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 signifikant höher als an dem Spaltmotiv zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase. In vitro Translationsstudien des NV-ORF1 im zellfreien System bestätigten, dass die kotranslationale in trans-Spaltung des Polyproteins nur zwischen dem Protein p37 und der 2CNTPase und der 2CNTPase und dem Protein p20 stattfand. Darüber hinaus konnte anhand dieses Versuches gezeigt werden, dass die initiale Prozessierung des Polyproteins auf der trans-Aktivität der 3CLpro beruht, was in der Freisetzung der Proteine p37, 2CNTPase und des Fusionsproteins VPg3CLpro[delta]3DLpol resultiert. Eine weitere Spaltung von VPg3CLpro[delta]3DLpol konnte im Rahmen dieses Versuches nicht gezeigt werden. Mit Hilfe des humanen Zellkultursystems sollte anschließend untersucht werden, ob zelluläre Faktoren in die Prozessierung des p20VPg Vorläuferproteins involviert sind. Dafür wurden Koexpressionsstudien des Vorläuferproteins p20VPg mit dem 3CLpro Vorläuferprotein [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durchgeführt. Doch auch in dieser Expressionsstudie konnte eine Spaltung des Vorläuferproteins nicht beobachtet werden. Interessanterweise wurde allerdings die cis-Spaltung des Vorläuferproteins [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durch die Koexpression mit [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol verhindert. Unter Verwendung des trans-Spaltungsassays konnte daraufhin in vitro verifiziert werden, dass p20VPg die Aktivität der 3CLpro am Peptid p37/2CNTPase signifikant reduzierte. Der initiale Schritt der NV-Replikation basiert auf der Aktivität der 3CLpro. Eine Inaktivierung dieses Enzyms würde demnach den Replikationszyklus verhindern. Somit stellt dieses Enzym ein geeignetes Target für anti-NV Medikamente dar. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit mögliche 3CLpro Inhibitoren getestet. Anhand dieser Testreihen konnte gezeigt werden, dass die Substanz CMK eine mögliche Grundlage, für die Entwicklung von NV-3CLpro spezifischen Chlormethylketon-Peptidanaloga als Inhibitoren, darstellen könnte.
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Der Replikation des NV-Genoms geht die kotranslationale Spaltung des vom ORF1 kodierten Polyproteins durch die viruseigene Protease, voraus. Erst in cis und in trans Prozessierungen an definierten Spaltmotiven innerhalb des Polyproteins ermöglichten die Freisetzung der strukturellen und nicht-strukturellen Proteine, die für den Aufbau des Replikationskomplexes und für die Initiation der Replikation essentiell sind. Die Regulation der Polyproteinprozessierung war allerdings bislang unbekannt. In der Charakterisierung der sequentiellen und differentiellen Prozessierung des Polyproteins bestand demnach die Hauptaufgabe dieser Arbeit. Dafür wurde zunächst ein NV-Volle-Länge-cDNA-Klon aus sechs sich überlappenden cDNA-Einzelfragmenten, unter Verwendung der overlap-extension PCR, hergestellt. Dieser Volle-Länge cDNA-Klon diente als Template für die Generierung von Vorläuferkonstrukten, die für die Charakterisierung der in cis und in trans Prozessierung des Polyproteins verwendet wurden. Die cis-Spaltung des Polyproteins konnte sowohl in E.coli als auch in humanen 293-T Zellen anhand eines Vorläuferproteins, das die komplette Sequenz der 3CLpro enthält, die 5`-seitig von der Spaltstelle zum VPg Protein und 3`-seitig vom N-Termins der 3DLpol flankiert ist, verifiziert werden. Infolge der kotranslationalen cis-Spaltung dieses Vorläuferproteins kam es zur Freisetzung der 3CLpro, die anschließend aufgereinigt wurde. Zusätzlich wurde das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol aufgereinigt, bei dem das Spaltmotiv E/G zwischen der 3CLpro und der 3DLpol so mutiert wurde, dass die kotranslationale Spaltung des Fusionsproteins verhindert wurde. Anhand der 3CLpro sowie dessen Vorläufers 3CLproµE1189A3DLpol sollte die differentielle und sequentielle Spaltung des Polyproteins in trans charakterisiert werden. Dafür wurden synthetisch hergestellte Peptide, die die authentischen Spaltmotive innerhalb des Polyproteins aufwiesen, sowohl mit der 3CLpro als auch mit der 3CLproµE1189A3DLpol in einem trans-Spaltungsassay inkubiert und anschließend die Spaltung mit Hilfe der reversed-phase Chromatographie analysiert. Im Rahmen dieser Versuche konnte gezeigt werden, dass nur die Spaltmotive zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase sowie zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 in trans von der 3CLpro gespalten wurden. Massenspektrometrische Analysen wiesen nach, dass die Spaltungen jeweils zwischen den Aminosäureresten Q/G stattgefunden hatte. Zusätzlich zu den Peptiden p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 konnte das Peptid VPg/3CLpro durch das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol an der Schnittstelle E/G prozessiert werden. Anhand von Berechnungen zur relativen Spalteffizienz von 3CLpro und 3CLproµE1189A3DLpol wurde nachgewiesen, dass 3CLpro eine signifikant höhere Spezifität zu den Spaltmotiven der Peptide p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 aufwies als das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol. Die Spaltspezifität der 3CLpro war dabei an dem Spaltmotiv zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 signifikant höher als an dem Spaltmotiv zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase. In vitro Translationsstudien des NV-ORF1 im zellfreien System bestätigten, dass die kotranslationale in trans-Spaltung des Polyproteins nur zwischen dem Protein p37 und der 2CNTPase und der 2CNTPase und dem Protein p20 stattfand. Darüber hinaus konnte anhand dieses Versuches gezeigt werden, dass die initiale Prozessierung des Polyproteins auf der trans-Aktivität der 3CLpro beruht, was in der Freisetzung der Proteine p37, 2CNTPase und des Fusionsproteins VPg3CLpro[delta]3DLpol resultiert. Eine weitere Spaltung von VPg3CLpro[delta]3DLpol konnte im Rahmen dieses Versuches nicht gezeigt werden. Mit Hilfe des humanen Zellkultursystems sollte anschließend untersucht werden, ob zelluläre Faktoren in die Prozessierung des p20VPg Vorläuferproteins involviert sind. Dafür wurden Koexpressionsstudien des Vorläuferproteins p20VPg mit dem 3CLpro Vorläuferprotein [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durchgeführt. Doch auch in dieser Expressionsstudie konnte eine Spaltung des Vorläuferproteins nicht beobachtet werden. Interessanterweise wurde allerdings die cis-Spaltung des Vorläuferproteins [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durch die Koexpression mit [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol verhindert. Unter Verwendung des trans-Spaltungsassays konnte daraufhin in vitro verifiziert werden, dass p20VPg die Aktivität der 3CLpro am Peptid p37/2CNTPase signifikant reduzierte. Der initiale Schritt der NV-Replikation basiert auf der Aktivität der 3CLpro. Eine Inaktivierung dieses Enzyms würde demnach den Replikationszyklus verhindern. Somit stellt dieses Enzym ein geeignetes Target für anti-NV Medikamente dar. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit mögliche 3CLpro Inhibitoren getestet. Anhand dieser Testreihen konnte gezeigt werden, dass die Substanz CMK eine mögliche Grundlage, für die Entwicklung von NV-3CLpro spezifischen Chlormethylketon-Peptidanaloga als Inhibitoren, darstellen könnte. |
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Scheffler, Ulrike, Untersuchungen zur Replikationsstrategie des humanpathogenen Norovirus Studies about the replication of the human pathogen norovirus, Dresden Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, txt, nc, Online-Ausg. 2008 Online-Ressource (Text) Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, Dissertation 2008, Der Replikation des NV-Genoms geht die kotranslationale Spaltung des vom ORF1 kodierten Polyproteins durch die viruseigene Protease, voraus. Erst in cis und in trans Prozessierungen an definierten Spaltmotiven innerhalb des Polyproteins ermöglichten die Freisetzung der strukturellen und nicht-strukturellen Proteine, die für den Aufbau des Replikationskomplexes und für die Initiation der Replikation essentiell sind. Die Regulation der Polyproteinprozessierung war allerdings bislang unbekannt. In der Charakterisierung der sequentiellen und differentiellen Prozessierung des Polyproteins bestand demnach die Hauptaufgabe dieser Arbeit. 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Zusätzlich wurde das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol aufgereinigt, bei dem das Spaltmotiv E/G zwischen der 3CLpro und der 3DLpol so mutiert wurde, dass die kotranslationale Spaltung des Fusionsproteins verhindert wurde. Anhand der 3CLpro sowie dessen Vorläufers 3CLproµE1189A3DLpol sollte die differentielle und sequentielle Spaltung des Polyproteins in trans charakterisiert werden. Dafür wurden synthetisch hergestellte Peptide, die die authentischen Spaltmotive innerhalb des Polyproteins aufwiesen, sowohl mit der 3CLpro als auch mit der 3CLproµE1189A3DLpol in einem trans-Spaltungsassay inkubiert und anschließend die Spaltung mit Hilfe der reversed-phase Chromatographie analysiert. Im Rahmen dieser Versuche konnte gezeigt werden, dass nur die Spaltmotive zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase sowie zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 in trans von der 3CLpro gespalten wurden. Massenspektrometrische Analysen wiesen nach, dass die Spaltungen jeweils zwischen den Aminosäureresten Q/G stattgefunden hatte. Zusätzlich zu den Peptiden p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 konnte das Peptid VPg/3CLpro durch das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol an der Schnittstelle E/G prozessiert werden. Anhand von Berechnungen zur relativen Spalteffizienz von 3CLpro und 3CLproµE1189A3DLpol wurde nachgewiesen, dass 3CLpro eine signifikant höhere Spezifität zu den Spaltmotiven der Peptide p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 aufwies als das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol. Die Spaltspezifität der 3CLpro war dabei an dem Spaltmotiv zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 signifikant höher als an dem Spaltmotiv zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase. In vitro Translationsstudien des NV-ORF1 im zellfreien System bestätigten, dass die kotranslationale in trans-Spaltung des Polyproteins nur zwischen dem Protein p37 und der 2CNTPase und der 2CNTPase und dem Protein p20 stattfand. Darüber hinaus konnte anhand dieses Versuches gezeigt werden, dass die initiale Prozessierung des Polyproteins auf der trans-Aktivität der 3CLpro beruht, was in der Freisetzung der Proteine p37, 2CNTPase und des Fusionsproteins VPg3CLpro[delta]3DLpol resultiert. Eine weitere Spaltung von VPg3CLpro[delta]3DLpol konnte im Rahmen dieses Versuches nicht gezeigt werden. Mit Hilfe des humanen Zellkultursystems sollte anschließend untersucht werden, ob zelluläre Faktoren in die Prozessierung des p20VPg Vorläuferproteins involviert sind. Dafür wurden Koexpressionsstudien des Vorläuferproteins p20VPg mit dem 3CLpro Vorläuferprotein [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durchgeführt. Doch auch in dieser Expressionsstudie konnte eine Spaltung des Vorläuferproteins nicht beobachtet werden. Interessanterweise wurde allerdings die cis-Spaltung des Vorläuferproteins [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol durch die Koexpression mit [delta]VPg3CLpro[delta]3DLpol verhindert. 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Scheffler, Ulrike, Untersuchungen zur Replikationsstrategie des humanpathogenen Norovirus: Studies about the replication of the human pathogen norovirus, Der Replikation des NV-Genoms geht die kotranslationale Spaltung des vom ORF1 kodierten Polyproteins durch die viruseigene Protease, voraus. Erst in cis und in trans Prozessierungen an definierten Spaltmotiven innerhalb des Polyproteins ermöglichten die Freisetzung der strukturellen und nicht-strukturellen Proteine, die für den Aufbau des Replikationskomplexes und für die Initiation der Replikation essentiell sind. Die Regulation der Polyproteinprozessierung war allerdings bislang unbekannt. In der Charakterisierung der sequentiellen und differentiellen Prozessierung des Polyproteins bestand demnach die Hauptaufgabe dieser Arbeit. Dafür wurde zunächst ein NV-Volle-Länge-cDNA-Klon aus sechs sich überlappenden cDNA-Einzelfragmenten, unter Verwendung der overlap-extension PCR, hergestellt. 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Anhand von Berechnungen zur relativen Spalteffizienz von 3CLpro und 3CLproµE1189A3DLpol wurde nachgewiesen, dass 3CLpro eine signifikant höhere Spezifität zu den Spaltmotiven der Peptide p37/2CNTPase und 2CNTPase/p20 aufwies als das Fusionsprotein 3CLproµE1189A3DLpol. Die Spaltspezifität der 3CLpro war dabei an dem Spaltmotiv zwischen der 2CNTPase und dem Protein p20 signifikant höher als an dem Spaltmotiv zwischen dem N-terminalem Protein p37 und der 2CNTPase. In vitro Translationsstudien des NV-ORF1 im zellfreien System bestätigten, dass die kotranslationale in trans-Spaltung des Polyproteins nur zwischen dem Protein p37 und der 2CNTPase und der 2CNTPase und dem Protein p20 stattfand. Darüber hinaus konnte anhand dieses Versuches gezeigt werden, dass die initiale Prozessierung des Polyproteins auf der trans-Aktivität der 3CLpro beruht, was in der Freisetzung der Proteine p37, 2CNTPase und des Fusionsproteins VPg3CLpro[delta]3DLpol resultiert. 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